分子辨識與感測器
台大化學系四年級 王宗興
簡介
一種能認識「物體」的裝置或許不是很稀奇，但若辨識的物體是小到眼睛看不到的「分子」呢？那情況將完全改觀了，因為我們將碰到兩項難題：怎麼去認識代測物、怎麼去知道有代測物？這兩大問號是接下去我們所要探討的主題。
分子辨識
分子辨識（molecular recognition）一直是化學家及分子生物學家等相當有興趣的課題，自然界中早就存在這許多極佳分子辨識的範例：像「生命」的特性內就少不了「分子辨識」。生物有極優美的分子辨識系統，但是我們對它們的了解在早期只是抽象的概念；一直到進入分子尺度的研究後才逐漸對分子辨識有進一步的了解。
所謂代測物，是待測或待分析的物種，又可稱為分析物（analyte）、受質（substrate）、客體（guest）或配基（ligand）；而在分子辨識中，能夠來辨識出受質的分子單元稱為受體（receptor）或主體（host）。受質與守體因互相辨識而形成複合物（complex），結合常數Ka（association constant）常常用來評估辨識的程度，Ka愈大表示平衡愈趨向右邊，複合物愈容易生成，即分子辨識愈好。
怎麼去認識代測物，靠的是「分子辨識」，而推動分子辨識的主要動力是「分子間的作用」；愈多受質與受體分子間的作用存在，則愈可有效的分子辨識。設計並製造一個分子辨識單元並不容易，這個研究題目本身就是很深奧而極度引人興趣；有大量研究者付出心力在設計具專一性（specificity）、強親和力（strong affinity）的受體上。
1.親合力（affinity）：指某一配基對受體的結合強度。通常以其結合的平衡常數或等價的結合自由能（DG,
free energy of binding）表示，這常是化學家的指標；而在生物學家因對應到直接觀測的方便性，也常常採用IC50（固定受體濃度下，配基抑制50%受體活性的濃度）。
2.專一性（specificity）：是選擇性（selectivity）的極端，簡單來說指某一受體對某一配基來說有比其他配基極度好之親合力；正確來說一般配基對某種結構的分子都有一定之選擇性（較強的親合力），但常以專一性來籠統稱呼，因必須有個概念：沒有絕對的專一性，再不易結合配基受體對還是有一定之親合力。
分子間的辨識往往需存在有兩個要素：一是分子間作用力（intramolecular
interaction）、還有互補的結構（complementary
structure）。
(1). 分子間作用力：
設計的受體欲辨識受質，不管從鑰匙與鎖模型（lock-and-key model）或是誘導填入模型（induced-fit model）來看，受體與受質間一定要有某種程度的靠近結合，在空間隔地很開很開（相對分子尺度而言）的分子是很難有作用的；因此分子辨識作用得要有「相吸引」的機制才行。這種作用是分子間的吸引力；在化學鍵的議題中，有提及許多分子間作用：
1.靜電作用：靜電作用（electrostatic
interaction）包括帶電偶極（electric
dipole）及帶電（charged）的分子之間靜電交互作用，強度變化大。其中偶極作用有方向性。
2.氫鍵：氫鍵（hydrogen
bonding）特殊的電偶極-電偶極作用（dipole-dipole
interaction），強度約是5-30
kcal/mol；分子間作用力也頗強。但對作用角度敏感。
3. 凡得瓦作用：凡得瓦作用（Van
der Waals interaction），是牽涉到誘導偶極（induced
dipole）作用，強度小於1-2
kcal/mol。
4. 疏水性作用：疏水性作用（hydrophobic
interaction）；即在水溶液中油性基團（oily
group）的聚集傾向，目的在減少水在油性基團外的溶合面積。
由於這些官能基與共軛官能基（能互補與其相吸引的基團）作用，使得分子間彼此吸引在數個埃（angstrom, Å, 1Å＝10-10m）內。
(2). 互補的結構：
若受質內具有不只一個可提供分子內作用的官能基後，則受體的共軛官能基的空間相對排列就相當重要了。也就是說，雖然有那麼多的吸引單元，但是每一個都要對上（match）才能達到最大的吸引力補償。這說起來很容易，但在分子的層次上就不簡單了；官能基間隔開用的連接端選擇設計：柔軟度（flexibility）、距離（distance）、構形（conformation）等等分子結構因素都必須好好地考慮。往往設計者很容易挑選出適當的互補共軛官能基，但要如何以分子角度「安置」它們？往往才是更大的挑戰。我們常常聽到「蛋白質中月生月太鏈三度空間構形是決定它功能的關鍵」正是如此；鑰匙與鎖模型和誘導填入模型外在、直觀上都是有考慮「形狀」的互補性，但內在、非圖示的分子間作用也必須隨時自我提醒著。
仔細看看上述分子間作用力的數量級，若相較於形成共價鍵或離子作用力，分子間的作用力強度並不算太大，大部分只算是弱的作用力（weak interaction）；作用力反應在辨識能力上，那單單弱的作用力如何說明生物中超高的辨識效果？秘訣就在「團結」。愈好的辨識一定要有愈高的結合自由能（association free energy，相當於親和力），即愈高結合常數（association constant, Ka）愈好。聯合許多弱的分子間作用，結合自由能慢慢還是能累積到驚人的高；但這又回到前述的要求：分子間作用一定要有互相加成的空間排列。
如此的聯合策略還有更深的目的，它隱含了對受質選擇性的存在。同樣是從一大群人找出一位候選者；只看中一個條件或是同時以多個要求的篩選，哪一種找到的準確度高？無疑地是後者。單一條件的篩選或許快，但出錯的情形更多；多個要求的篩選雖慢，但不易出錯。
1987年的諾貝爾化學獎頒給Donald J. Cram, Jean-Marie Lehn及Charles J. Pedersen等三人，他們的工作主要是有關於超分子化學（supramolecular chemistry）；我們舉其中有關冠醚的部分作離子說明：冠醚指的是大環的環狀多醚類；如下圖的 [15]crown-5, [18]crown-6及[21]crown-7等三種冠醚，其中方括弧內的數字表示大環總原子數、而短線後的數字則是大環中可供配位原子（這裡指氧原子）的數目。
這些冠醚對陽離子有不錯的結合能力，但值得注意的是 [15]crown-5對鈉離子（Na+）的親和力較好；而類似地情況，[18]crown-6及[21]crown-7分別與鉀離子（K+）及銫離子（Cs+）選擇性互補。冠醚對陽離子的「辨識」來自氧原子上的孤對電子（lone pair electrons）；而不同冠醚對不同陽離子的選擇性則來自冠醚上各個氧的配置，[18]crown-6的六個氧的配置對鈉離子比較遠、對銫離子又太近（就像戴不緊的帽子，頭不是在帽子內而是偏向一邊），在作用都未達到最適化，也有用腔孔大小來說明 [18]crown-6對鉀離子是較好的安排。（注意！[18]crown-6對Na+的結合能力其實也不弱，甚至比[15]crown-5好；因此上述傾向是相對的）
這種預安置（preorganization）的腔狀（cavity）結構，「排好好地」等著辨識受質，正與先前探討辨識原理不謀而合。預安置的策略，可補償因辨識形成複合物而損失的熵值（entropy）；換句話說：搖擺不定的辨識基團在辨識時，需要額外付出「能量」引導它朝向正確的方位，自然就不利親和力了。若是未環成大環的多醚類，雖然有相似的分子作用力官能基，但其選擇性及親和力都是很差的。
「物質分析」是科學家最常做的一項工作；對於每一個在自己實驗室中的未知樣品，其中含有什麼（what）？含有多少（how many）？是研究者首先必須面對的挑戰。太仔細地分析無疑是耗時、耗心力又不見得有實際價值；或許我們只對某種分析物（analyte）它是否存在（exist）？量的多寡或濃度（amount or concentration）？才有興趣。但不管是定性（qualitative）或是定量（quantitative）上的資訊，操作簡單、快速得到結果的分析方法卻是分析上發展的趨勢。
酸鹼指示劑－實用的感測器：
一杯澄清的水溶液中，要如何知道它的酸鹼性？或許用舌頭嚐一嚐，酸酸或是澀澀的馬上感覺出來了，但是這未免有些冒險了。古早的農夫就是如此冒險地在測試土壤的酸鹼度，這卻也激起了科學家尋找看安全的方法取而代之來檢驗酸鹼性；而從植物中找到了許多色素可做為酸鹼性的「指示劑」（indicator）。
指示劑的操作及觀測十分簡單：將代測之樣品溶液取出一部份，加入指示劑液；直接觀察溶液中指示劑劑顏色的變化。舉個例子：以酚太（phenolphthalein）作為指示劑，則在酸性下酚太呈無色、而鹼性下酚太轉變成粉紅色了。就分子層次上，詳細的變色過程如下式：
若僅僅認定酚太指示出了氫氧根離子的存在，那就太單純小看其能力了；事實上酚太的變色可約略透露出「量」的訊息：在以水為溶劑下，氫離子濃度大於10-8 M（即pH＜8）則指示劑呈無色，而氫離子濃度小於10-10 M（即pH＞10）則指示劑將出現明顯的粉紅色了。
酚太指示劑其實可算是一種氫氧根離子感測器（hydroxide
ion sensor）：指示劑與待測受質（substrate）可逆的結合導致共軛結構的改變，進而產生顏色吸收的變化，最後此顏色改變可直接被觀測者讀出。
感測器的組成：
上面所簡單展示的酸鹼指示劑，卻也點出了感測器組成的訊息。一般說來，要構成感測器（sensor）必須要有兩個基本部分：一是分子辨識單元（molecular
recognition unit）、二是信號轉換單元（signal transduction
unit）。如所示：
(1).
分子辨識單元：
用來與待測受質（即分析物）交互作用（interaction）的部分。也就是類似一個「陷阱」，可以吸引受質並「捕獲」住；再接著引起後續的信號傳遞（signal
transduction）。設計分子辨識單元有兩項指標：愈高的選擇性（selectivity）及愈強的親和力（affinity）愈好。基本上從生物分子中（如：酵素enzyme、抗體antibody等等）所取得的辨識單元經千萬年演化正具極高的選擇性及很強親和力，科學家們利用它們來建構感測器，因此常通稱為生物感測器（biosensor）。也有研究者自行設計或是類比天然的生物分子，利用合成技術製造出感測器，通稱為化學感測器（chemosensor）；或許現今化學感測器分子辨識單元的選擇性及親和力還無法媲美生物感測器，但是生物分子辨識單元的受質受限於常常只與生物有關，但以分子設計的受質應該是沒有任何限制。因此化學感測器或是分子辨識單元正快速地發展著。
(2).
信號轉換單元：
我們無法看到受質是否被分子辨識單元「辨識」，因此感測器中需要有告訴我們的讀出單元（readout
unit），即將分子的辨識行為直接（direct）轉換為可被讀出的訊號。常用的轉換信號方式有兩種：可轉換成電化學訊號（electrochemical
signal）或光學信號（optical
signal）。電學訊號可能以導電度（conductivity）改變或電位（electric
potential）變化來表現；光學信號則有顏色變化或莫爾吸光係數（molar
absorption coefficient）的改變，或是更靈敏的螢光強度（fluorescence
intensity）增減或波長移動。
感測器的整個作用流程可從中看出：首先感測器的分子辨識單元與受質進行可逆非共價性錯合平衡，而被辨識形成複合物，複合物中感測器部分的信號轉換單元因受質結合藉由「某些機制」而被誘導致物理化學信號改變，這信號變化經由儀器監測而直接被觀測到。
分子辨識與信號傳遞兩單元的整合是相當重要的，它直接反應到微觀（microscopic）的分子行為是否能有效的被直接巨觀（macroscopic）讀出。有極佳的分子辨識單元但無法輕易被觀察，算是設計不良的感測器；有極靈敏的信號傳遞單元但無法辨識特定受質，也是無用。之後我們談到的感測器比較偏向以光學信號方式讀出，特別是以螢光訊號表現的螢光化學感測器（fluorescent chemosensor）。
當我們專注在螢光化學感測器中，很直覺地可聯想出有兩種單元整合的方式：自身型螢光化學感測器（intrinsic fluorescent chemosensor）、聯合型螢光化學感測器（conjugate fluorescent chemosensor）。
所謂自身型螢光感測器是指辨識單元中與受質作用的部分有包含在螢光基團（fluorphore）（即信號轉換單元）內，亦即受質的被辨識直接影響到螢光基團光物理化學性質。而聯合型螢光化學感測器中，辨識單元與螢光基團是「絕緣地」被一些其他連接元（linker）連接在感測器分子內，受質的被辨識是間接反應在螢光基團。千萬不要認定分子辨識及信號傳遞單元有明顯的分界；但不管如何，有辨識行為一定會導致螢光基團受擾動到。
先前提到酚太指示劑，若照上面介紹的名詞分類來看，則是屬於「自身型吸收色化學感測器」的類型；「辨識」氫氧根離子的部分包含在發色團（chromophore）中，有無辨識到受質將「極劇」改變發色團
p 電子共軛而造成發色團從吸收紫外光移動為吸收552nm可見光，表現出的互補色正是從無色轉成粉紅色。補充一點：酚太的辨識機制是利用酚基上酸性氫（acidic
hydrogen）對鹼性氫氧根離子的敏感度；是很單純的酸鹼平衡，並不像一般分子辨識機制需要一大堆弱作用力（weak
interaction）的那般複雜。
讀者或許可發現，其實感測器與之前的分子辨識主體就只差在：前者多了信號轉換單元而已。針對螢光化學感測器，下列我們列了一些感測器的實際例子。
(1).
準分子的形成（Excimer
Formation）：
在未與鈉離子結合時，AAO5O5中的環醚部分可曲性高，使得其上兩個anthracene螢光團是分離的，表現地有如anthracene一般；但在過量鈉離子存在下，環醚部分與鈉離子結合而導致構形改變且較剛硬，使兩個anthracene接近而有
p-p
堆積作用（p-p stacking
interaction）形成準分子（eximer），準分子是激發態的anthracene及另一基態anthracene所重新排列分子軌域，所放出之螢光將明顯的紅位移（red
shift）；由此螢光的紅位移，我們可知道是否有鈉離子與AAO5O5結合。這屬於聯合型螢光化學感測器的一種。
在未結上鉀離子時，窩穴體（cryptand,
類似冠醚，但有更多的結合位且有如洞穴）架橋上的氮原子會參與香豆素（coumarin）發光團的光激發過程：香豆素電子基態在光激發下，激發到電荷較分離的激發態；未鍵結的氮原子因能階較高而將電子轉移至香豆素基態上，導致激發態的電子無法回到基態放出螢光。在錯合上鉀離子後，氮原子的電子形成鍵穩定化而不能提供電子；香豆素的螢光過程不受干擾而放出螢光。由此螢光的增強與否，我們可知道是否有鉀離子與感測器結合。
(3).
能量傳遞（Energy
Transfer）：
在未錯合上金屬離子時，能量提供者（donor）及能量接受者（acceptor）被可饒曲多醚鍊分開在頗遠的地方；因此當激發donor時所放出的螢光大部分都是donor本身的螢光。當錯合上金屬離子時，donor及acceptor被帶到鄰近的地方；此時激發donor時，因距離夠近使donor激發態能量有效率地轉移至acceptor，導致發出acceptor的螢光。這種螢光波長的變化可作為受質是否結合的依據。有時的acceptor並不會發出螢光（此acceptor稱為quencher），那就造成螢光驟減（quenching）了。這種驟減機制可設計成反過來的感測機制，即原先donor及quencher在一起，螢光不強；當受質結合時迫使quencher遠離donor，那螢光就增強了。欲造成能量傳遞傳遞的現象需有些要求：
1.適當的距離：
能量轉移是藉由螢光團之間的偶極-偶極作用，因此與兩螢光團間有極大關係。能量轉移效率E可表示成兩螢光團間距離R的關係：
其中R0指Förster距離（Förster distance），表能量轉移速率洽等於其他路徑速率時的距離，亦即50%螢光共振能量轉移。我們假設感測器在結合前後，兩螢光團之間的距離有明顯的變化時（特別在R0附近），藉由螢光共振能量轉移機制，我們應該就可看到螢光素螢光強度的增加、香豆素螢光強度減少。
2. 光譜要求：
當傳出能量donor的螢光光譜與接受能量acceptor的吸收光譜有重疊時才可能有螢光共振能量轉移，當重疊愈大時能量轉移愈容易。基本上光譜有重疊表示它們的能階有重疊，共振（resonance）本來就是在等能量時最強了，當等能階愈多（重疊愈大）時共振效率自然提高。
參考資料
1. Czarnik, A. W., Ed. Fluorescent Chemosensor For Ion and Molecule Recognition 1992, ACS: Washington, DC
2. Steed, J. W., Atwood, J.L., Ed. Supramolecular Chemistry 2000, John Wiley & Son. Ltd.
90/7/17